Çevresel streslerin Shiga toksini üreten Escherichia coli bakterilerinin hayatta kalması ve sitotoksisitesi üzerindeki etkisi

Brian Byongkwon Yoo, Yanhong Liu, Vijay Juneja, Lihan Huang, Cheng-An Hwang

*Food Quality and Safety, Cilt 1, Sayı 2, 1 Mayıs 2017, sayfa 139–146, https://doi.org/10.1093/fqsafe/fyx010

Özet

Bu çalışmanın amacı, çevresel streslerin Shiga toksini üreten Escherichia coli (STEC) bakterilerinin sitotoksisitesi üzerindeki etkisini belirlemekti. STEC O157: H7 ve O157 dışı altı STEC suşu (O26: H11, O103: H1, O104: H4, O111: NM, O121: NM ve O145: NM); ozmotik (aw 0,95–0,98), asit (pH 4–7) ve klor (1–5 ppm) streslerine maruz bırakıldı. Stres uygulamalarından sonra bakteri popülasyonları, virülansla ilişkili genlerin ekspresyonu ve Vero hücrelerindeki sitotoksisite belirlendi. Suşlar arasında O145: NM, aw 0,97’de diğer serotiplerden daha uzun süre hayatta kalırken O111: NM, ozmotik strese anlamlı ölçüde daha duyarlıydı. pH 4’te O103: H1 strese daha dirençliydi; O26: H11 ve O111: NM ise anlamlı ölçüde daha az gelişim gösterdi. 2 ppm klor stresinde O26: H11, O103: H1 ve O145: NM popülasyonları diğer suşlardan daha yüksekti (>3 log). Strese maruz kalan O103: H1, O104: H4 ve O145: NM suşlarında, stressiz kontrole kıyasla stx1, stx2 ve eae genlerinin göreli ekspresyon düzeylerinde anlamlı artış görüldü. Ayrıca laktat dehidrogenaz deneyiyle gösterildiği üzere stres uygulanmış O26: H11, O103: H1, O104: H4 ve O145: NM suşlarında Vero-sitotoksisitesi anlamlı ölçüde daha yüksekti. Sonuçlar, seçilen patojenik E. coli suşlarının gelişiminin ve sitotoksisitesinin çevresel streslere maruz kaldıktan sonra artabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Shiga toksini üreten Escherichia coli (STEC), kanlı ishal, hemolitik üremik sendrom ve ölümle sonuçlanabilen ağır gıda kaynaklı hastalıklara neden olur. STEC serotipleri arasında E. coli O157: H7, diğer serotiplerden daha fazla gıda kaynaklı hastalık salgınıyla ilişkilendirildiği için başlıca ilgi odağıdır. Son yıllarda O157 dışı STEC’lerin insan hastalıklarına neden olduğuna ilişkin farkındalığın artması; bu mikroorganizmaların klinik tanısının, araştırılmasının ve sürveyansının genişlemesini sağlamıştır (Gould ve ark., 2013). İnsanlardan ayrıca 380’den fazla başka STEC serotipi izole edilmiştir (Karmali ve ark., 2010). ABD’de 1983–2002 döneminde O157 dışı STEC enfeksiyonlarının %70’inden fazlasından, 13 serotipi içeren altı E. coli O grubunun sorumlu olduğu bilinmektedir (Brooks ve ark., 2005). O157 dışı STEC suşları, O157 STEC’nin neden olduğu hastalıklara benzer hastalıklara yol açar. Virülans; stx 1 veya stx 2 (Shiga toksini), eae (intimin), hly (enterohemolizin), nle (enterosit silinme lokusu [LEE] dışında kodlanan efektör protein), saa (STEC’nin kendiliğinden aglütinasyon sağlayan adezini) ve subAB (subtilaz sitotoksini) gibi virülans genlerinin bulunmasıyla ilişkilidir (Paton ve ark., 2004; Mingle ve ark., 2012). Bu virülans geni profilleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile başarıyla ortaya konmuştur (Monaghan ve ark., 2011). Patojenitede rol oynayan çeşitli virülans faktörleri arasında Shiga toksini, insanlarda ağır hastalıkların oluşumunda başlıca rolü üstlenir (Thorpe, 2004). Stx ailesi Stx1 ve Stx2’den oluşur. Stx1 oldukça homojendir; Stx2’nin ise çeşitli varyantları vardır (Ju ve ark., 2012). Hem Stx1 hem de Stx2, bağırsak segmenti modelinde enterotoksik etki göstererek fare ve tavşanlarda ölüme yol açar; ayrıca çeşitli hücre kültürü modellerinde sitotoksiktir. Memeli hücrelerinin canlılığını hücre çoğalması veya ölümü üzerinden ölçmek için sitotoksisite deneyleri geliştirilmiştir. Hücre ölümünü değerlendirmede kullanılan ölçütlerden biri, hasar gören hücrelerden salınan sitoplazmik enzim etkinliğiyle ölçülebilen hücre zarı bütünlüğüdür. STEC enfeksiyonlarının tanısında Vero hücresi sitotoksisite deneyi kullanılmıştır (Paton ve Paton, 2003). Vero hücrelerinin plazma zarlarında yüksek yoğunlukta Gb3 reseptörleri ve ayrıca Stx2e’nin tercih ettiği reseptör olan Gb4 bulunur; bu nedenle bilinen bütün Stx varyantlarına son derece duyarlıdırlar.

Gıda üretim süreçleri, bakterileri olumsuz koşullara maruz bırakarak inaktive etmek ve böylece bakteriyel homeostazı bozmak üzere tasarlanır. STEC’nin öldürücü olmayan çevresel streslere yanıt verdiği bilinmektedir (Montet ve ark., 2009). Bakterilerin gıda işleme sırasında karşılaşabildiği ozmotik stres, hafif asidik ortam ve klor uygulaması gibi çeşitli öldürücü olmayan işleme stresleri, sonraki işlem basamaklarında ve olumsuz çevresel koşullarda hayatta kalmalarına ve virülansla ilişkili genlerin daha fazla ifade edilmesine olanak sağlayabilir (Williams ve ark., 2000; House ve ark., 2009). Başka bir deyişle, öldürücü olmayan streslerden sonra toparlanmakta olan veya toparlanmış bakteriler, hasarın onarılması sonucunda virülansla ilişkili genlerin ekspresyonunda değişiklik gösterebilir (Price ve ark., 2000; Olesen ve Jespersen, 2010).

Suda çözünmüş sodyum hipoklorit (NaOCl), gıda sektöründe ekipmanı sanitize etmek ve taze meyve-sebzelerdeki mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için yaygın olarak kullanılır (Erkmen, 2010; Althaus ve ark., 2012). Daha önce klor uygulamasına maruz kalmış mikroorganizmalar hayatta kalarak tüketiciler tarafından alınabilir. Taze ürünlerin neden olduğu iki gıda kaynaklı hastalık salgınıyla bağlantılı E. coli O157: H7 suşları üzerinde yapılan yakın tarihli tüm genom mikrodizi çalışmalarında; Japonya’daki 1996 filiz salgınından elde edilen klinik izolat Sakai’de (Michino ve ark., 1999) toplam 240 genin, ABD’deki 2006 ıspanak salgınından elde edilen TW14359 izolatında (Centers for Disease Control and Prevention, 2006) ise TW14359’da 140 genin farklı biçimde düzenlendiği belirlenmiştir (Deng ve ark., 2011). Çeşitli transkriptomik analizlere rağmen hiçbir çalışma, öldürücü olmayan klor stresinin patojenik E. coli’nin virülansını değiştirebileceğini ortaya koymamıştır. Ayrıca O157 dışı STEC’lerin klinik öneminin giderek daha çok tanınmasına karşın, O157 dışı STEC’nin strese nasıl yanıt verdiği ve stresin sitotoksisite üzerindeki etkisi hakkında yeterli bilgi yoktur. Sitotoksisite, Shiga toksini üretim düzeylerinin ve virülansın bir göstergesi olabilir. Bu çalışmanın amacı, belirli stres koşulları altında O157 dışı STEC’lerin Shiga toksini üretiminde nicel bir değişiklik olup olmadığını Vero-sitotoksisite deneyleriyle incelemekti.

Materyal ve yöntemler

STEC suşları

O157 dışı altı E. coli suşu — O26: H11 (05-6544), O103: H1 (04/62), O104: H4 (2009EL-2050), O111: NM (98–8338), O121: NM (03-406) ve O145: NM (03-4699) — Dr. Pina Fratamico (ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisleri, Wyndmoor, PA) tarafından sağlandı. ATCC 43888, 43889 ve 43890 numaralı E. coli O157: H7 suşları bir kokteyl karışımı olarak kullanıldı. Her suş, beyin-kalp infüzyon besiyerinde (BHI; BD Biosciences, Sparks, MD), 37 °C’de ve 200 rpm’de çalkalayıcı üzerinde bir gece geliştirildi. Hücreler geç logaritmik gelişme evresinde (~108 CFU/ml) toplandı.

Ozmotik stres

Farklı su aktivitelerine sahip stok çözeltiler, deney gününde taze olarak hazırlandı. 100 ml triptik soya besiyerinde (TSB; BD Biosciences) farklı su aktivitesi düzeyleri (aw 0,95, 0,96, 0,97 ve 0,98) elde etmek için sırasıyla 8,5, 7, 5,25 ve 3,5 g NaCl (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ) kullanıldı. Su aktivitesi, bilinen su aktivitelerine sahip doymuş tuz çözeltileriyle kalibre edilmiş AquaLab su aktivitesi ölçeri (Decagon Devices, Pullman, WA) kullanılarak ölçüldü. Bir gece geliştirilmiş E. coli hücre süspansiyonu kültürlerinden 10 ml alınarak pelet oluşturuldu (2800 × g, 2 dakika, 4 °C), fosfat tamponlu tuzlu suyla (PBS) iki kez yıkandı ve son konsantrasyon ~103 CFU/ml olacak şekilde steril damıtılmış suyla (DW) seyreltildi. Numuneler 22 °C’de inkübe edildi; inkübasyonun 7, 14 ve 21. günlerinde örnekleme yapıldı. Her örnekleme noktasında 1 ml hücre süspansiyonu alındı ve PBS içinde seri olarak seyreltildi. Hücre sayıları, çözeltinin 0,1 ml’sinin triptik soya agar (TSA; BD Biosciences) plaklarına ekilmesiyle belirlendi. Plaklar 37 °C’de 24–48 saat inkübe edildi ve tipik koloniler sayıldı.

Asidik stres

TSB, 1 N hidroklorik asit (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) kullanılarak pH 7, 6, 5 veya 4’e asitlendirildi. Asitlendirilmiş TSB, 0,22 µm’lik Corning filtre birimleriyle (Costar, Corning, NY) sterilize edildi. E. coli hücreleri, hazırlanan asitlendirilmiş PBS çözeltilerinin (10 ml) her birine ayrı ayrı inoküle edilerek son hücre konsantrasyonunun yaklaşık 103 CFU/ml olması sağlandı. İnoküle edilmiş besiyeri, 22 °C’de 21 gün inkübe edildi. İnkübasyonun 7, 14 ve 21. günlerinde örnekler alındı. Her örnekleme noktasında, her hücre süspansiyonundan 1 ml alınarak PBS içinde seri seyreltme yapıldı. Test edilen her numunenin uygun üç seyreltisinden 0,1 ml alınarak ikişer TSA plağına ekildi. İnoküle edilmiş plaklar, koloniler sayılmadan önce 37 °C’de 24–48 saat inkübe edildi.

Klor stresi

NaOCl stok çözeltileri, deney gününde %5’lik NaOCl’nin (Fisher Scientific) steril damıtılmış suda (22 °C) seyreltilmesiyle farklı NaOCl konsantrasyonları verecek şekilde taze hazırlandı. Her STEC suşu, 8 log CFU/ml düzeyinde, 22 °C’de 24 saat boyunca NaOCl’ye (1, 2 ve 5 ppm) maruz bırakıldı. 37 °C’de bir gece geliştirilmiş STEC hücre süspansiyonu kültürlerinden 10 ml alınarak pelet oluşturuldu (2800 × g, 2 dakika, 4 °C), PBS ile iki kez yıkandı ve son konsantrasyon ~107 CFU/ml olacak şekilde klorlanmış damıtılmış suyla seyreltildi. Klorlanmış damıtılmış suda 24 saatlik inkübasyon sırasında, her örnekleme zamanında (1, 6 ve 24 saat) her tüpten 1 ml sıvı alınarak PBS ve filtreyle sterilize edilmiş nötralizasyon reaktifi (2 µg/ml sodyum tiyosülfat; Fisher Scientific) içeren deney tüplerine hemen aktarıldı. İşlem sonrası hücreler, çözeltinin 0,1 ml’sinin TSA plaklarına ekilmesi ve 37 °C’de 24 saat inkübe edilmesiyle sayıldı. 2 ppm klora 24 saat maruz kaldıktan sonra hayatta kalan STEC hücreleri toplandı ve yeniden 24 saatlik klor uygulamasına alındı. Ardışık dört uygulamanın ardından, her klor stresi uygulanmış STEC suşunun dördüncü nesli (G3) ve her nesil (G0, G1, G2 ve G3), sitotoksisite deneylerinde kullanılıncaya kadar saklandı ve donduruldu.

Virülansla ilişkili genlerin nicel analizi

37 °C’de bir gece geliştirilmiş bakteri hücrelerinden 1 ml, 17 900 × g’de 3 dakika santrifüj edilerek toplandı. Üst faz uzaklaştırıldıktan sonra pelete, üreticinin talimatlarına göre RiboPure™-Bacteria Kiti (Ambion Inc., Austin, TX) kullanılarak bakteriyel RNA izolasyonu uygulandı. RNA, TE tamponuyla (pH 8’de 10 mM Tris–HCl ve 1 mM EDTA) elüe edildi. RNA konsantrasyonu, Nanodrop® ND100 UV–Vis spektrofotometresi (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) kullanılarak 260 ve 280 nm’deki absorbans okumalarıyla değerlendirildi. Kalıntı DNA kontaminasyonunu önlemek için cDNA sentezinden önce üreticinin talimatlarına göre DNaz I işlemi uygulandı.

Ardından RNA (2 µg), üreticinin önerdiği şekilde SuperScript III First Strand Synthesis kiti (Invitrogen, Carlsbad, CA) kullanılarak cDNA sentezinde kullanıldı. cDNA (10 ng), 2x Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ile her primerden (stx 1, stx 2, eae ve mdh) 250 nM içeren 25 µl’lik PCR reaksiyon karışımına eklendi. stx 1, stx 2, eae ve mdh genleri için PCR, Tablo 1’de açıklandığı üzere ilgili primer çiftleriyle (Fratamico ve ark., 2011) gerçekleştirildi. PCR örnekleri, 7500 Fast RT-PCR Systems (Applied Biosystems) cihazında önce 95 °C’de 10 dakika; ardından 95 °C’de 15 saniye ve 55 °C’de 1 dakikadan oluşan 35 döngüyle çoğaltıldı. PCR reaksiyonuna negatif kontrol olarak DNA içermeyen şablonlar dâhil edildi. stx1, stx2 ve eae genlerinin Ct (eşik döngü) değerlerini normalize etmek için hücresel temel işlev geni mdh iç kontrol olarak kullanıldı. Strese maruz kalan hücrelerde bu virülans genlerinin göreli ekspresyonu, kontrol hücrelerindeki karşılık gelen genlerin ekspresyon düzeylerine göre normalize edilerek hesaplandı. Δ Ct, ΔΔ Ct ve 2ˉfx değerleri Pfaffl’ın (2001) açıkladığı şekilde hesaplandı.

Tablo 1.

Bu çalışmada qRT-PCR için kullanılan primer çiftleri.

Primer	Dizi (5′–3′)	Hedef gen
stx1-F	GAC TGC AAA GAC GTA TGT AGA TTC G	stx1
stx1-R	ATC TAT CCC TCT GAC ATC AAC TGC
stx2-F	ATT AAC CAC ACC CCA CCG	stx2
stx2-R	GTC ATG GAA ACC GTT GTC AC
eae-F	CTT TGA CGG TAG TTC ACT GGA C	eae
eae-R	CAA TGA AGA CGT TAT AGC CCA AC
mdh-F	AGT ACT CCC GTT TCT CT	mdh
mdh-R	CAG GGC GAT ATC TTT CTT GA

Büyük görüntüle

Vero-sitotoksisite deneyleri

Sitotoksisite, Vero hücreleri (ATCC CCL-81; Afrika yeşil maymunu böbrek epitel hücre hattı) kullanılarak belirlendi. Hasarlı hücrelerin sitozolünden hücre dışı ortama salınan LDH’nin ölçülmesine dayanan laktat dehidrogenaz (LDH) deneyi, hücre ölümünü nicel olarak belirlemek için kullanıldı. LDH, tüm bakteri hücresi türlerinin sitozolünde bulunan kararlı bir sitoplazmik enzimdir. Plazma zarı hasar gördüğünde hücre dışına salınır (Korzeniewski ve Callewaert, 1983). LDH etkinliği, iki basamaklı bir enzimatik testle belirlenir. İlk basamak, LDH’nin katalizlediği laktatın pirüvata dönüşümü yoluyla NAD+’nın NADH/H+’ya indirgenmesidir. İkinci basamakta katalizör (diyaforaz), NADH/H+’dan H/H+’yı tetrazolyum tuzu 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolyum klorüre aktarır; bu tuz kırmızı formazana indirgenir (Lappalainen ve ark., 1994). Deneyler için 96 kuyucuklu plakalara alt konfluens düzeyindeki Vero hücrelerinin tek tabakası ekildi. Normal BHI besiyerinde bir gece geliştirilerek geç üstel veya erken durağan evreye ulaşmış STEC hücreleri (G3 veya kontrol) toplandı ve hücre dışı ortama salınan Shiga toksinini içeren üst fazları elde etmek için filtreyle sterilize edildi. Vero hücreleri, filtreyle sterilize edilmiş üst fazlara 37 °C’de, %5 CO2 içeren inkübatörde 24 saat veya 48 saate kadar maruz bırakıldı. İnkübasyondan sonra LDH salınımı, üreticinin talimatlarına göre Cytotoxicity Detection Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) kullanılarak ölçüldü. Kendiliğinden LDH salınımı (= düşük kontrol), deney ortamında 100 µl hücre içeren kuyucuklara, pirüvat içermeyen ve %1 fötal sığır serumu bulunan 100 µl deney ortamı eklenerek belirlendi. En yüksek LDH salınımı (= yüksek kontrol), deney ortamında 100 μl hücre içeren her kuyucuğa 100 µl Triton X-100 çözeltisi (Sigma, St. Louis, MO; deney ortamında %2 Triton X-100) eklenerek belirlendi. Salınan LDH miktarı; her kuyucuktan 100 µl üst fazın optik olarak saydam, düz tabanlı 96 kuyucuklu mikroplakalara (Corning) aktarılması, kuyucuklara 100 µl reaksiyon karışımı eklenmesi, oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edilmesi ve Saffire2 mikroplaka okuyucusuyla (Tecan, Morrisville, NC) 620 nm referans dalga boyu kullanılarak 492 nm’de absorbansın ölçülmesiyle belirlendi. LDH sitotoksisite tespit deneyinde sitotoksisite yüzdesi, optik yoğunluk okumaları kullanılarak hesaplandı:

Sitotoksisite (%) = [(deney değeri − düşük kontrol) / (yüksek kontrol − düşük kontrol)] × 100

Sitotoksisite (%) = [(deney değeri − düşük kontrol) / (yüksek kontrol − düşük kontrol)] × 100

Ölçülen sitotoksisite, üst fazların toplandığı andaki hücre popülasyonuna göre normalize edildi. Her numune üç paralel olarak test edildi. Her numune için en az üç bağımsız deney yapıldı.

İstatistiksel analiz

Her deney iki paralel olarak yürütüldü ve üç kez tekrarlandı. Çalışmada toplanan veriler, Statistical Analysis Software yazılımındaki (SAS Institute Inc., Cary, NC) Student t testiyle analiz edildi. Test edilen STEC suşlarının çeşitli uygulamalardaki hayatta kalma düzeyleri arasındaki farkların anlamlılığı α = 0,05 düzeyinde belirlendi.

Bulgular ve Tartışma

Ozmotik stres altında hayatta kalma

22 °C’de 3 hafta boyunca dört farklı ozmotik stres düzeyine (aw 0,95, 0,96, 0,97 ve 0,98) maruz bırakılan üç suşlu E. coli O157: H7 kokteylleri ile altı O157 dışı STEC suşunun (O26: H11, O103: H1, O104: H4, O111: NM, O121: NM ve O145: NM) popülasyonları Şekil 1A’da gösterilmiştir. Çoğu gıdanın su aktivitesi 0,95 veya üzerindedir; gelişim açısından kontrole benzer sonuç verdiği için bu deneye aw 0,99 dâhil edilmemiştir. aw 0,95 ve 0,96’da, test edilen tüm suşlar bir haftalık inkübasyondan sonra çok az farklılıkla saptanamayacak düzeylere düşmüştür. aw 0,97’de, E. coli O145: NM suşunun 7,6 log CFU/ml’lik popülasyonu 21 günlük inkübasyon boyunca ozmotik stres altında hayatta kalırken diğer suşlar bir hafta sonra saptanmamıştır. Ozmotik strese en duyarlı olan E. coli O111: NM, aw 0,98’de bile ozmolariteye 7 gün dayanamamıştır. Diğer suşlar 21 gün boyunca benzer gelişim göstermiştir. Önceki çalışmalar (Baylis ve ark., 2004; Hiramatsu ve ark., 2005), E. coli O157 ve O157 dışı STEC suşlarının ozmotik stres altında benzer gelişim örüntüleri gösterdiğini ortaya koymuştur. Çalışmamızda da O157 dışı ve O157 STEC suşlarının çoğu benzer gelişim örüntüleri göstermiştir. Bu bulgu, diğer suşlarla karşılaştırıldığında aw 0,97’de anlamlı derecede daha fazla gelişim gösteren E. coli O145: NM dışında önceki bulgularla tutarlıdır. Çevresel ozmotik basınçtaki artışın, suyun hücre dışına kaybedilmesi yoluyla metabolik etkinlikleri bozduğu ve bunun STEC hücre zarının parçalanmasına yol açtığı ileri sürülmüştür (Beney ve ark., 2004; Yoo ve Chen, 2010).

Şekil 1.

Büyük görüntüle Slaytı indir

O157 dışı Shiga toksini üreten Escherichia coli (STEC), ozmotik ve asidik stresler altında E. coli O157’ye benzer hayatta kalma örüntüleri gösterir. STEC’nin (O26: H11, O103: H1, O104: H4, O111: NM, O121: NM, O145: NM ve O157: H7), farklı (A) ozmotik basınç [aw 0,98 (a), 0,97 (b), 0,96 (c) ve 0,95 (d)] ve (B) asidik stres [pH 7 (a), 6 (b), 5 (c) ve 4 (d)] düzeylerindeki hayatta kalma eğrileri çizilmiştir. Hücreler 3 log CFU/ml düzeyinde inoküle edilmiş ve 22 °C’de 3 hafta inkübe edilmiştir. Hayatta kalan hücreler 37 °C’de triptik soya agar (TSA) plaklarında sayılmıştır. Üç bağımsız deneyden elde edilen veriler ortalamalar olarak sunulmuştur.

Asidik stres altında hayatta kalma

Başlangıç bakteri popülasyonları 3 log CFU/ml olan yedi STEC suşu, 22 °C’de 3 hafta boyunca dört farklı pH düzeyine (4, 5, 6 ve 7) maruz bırakılmıştır (Şekil 1B). Farklı pH düzeyleri seçilirken yakın dönemdeki salgınlarla ilişkili domates (pH 4–5), kıyma (pH 5–6), Romaine marulu (pH 6) ve ıspanak (pH 6–7) gibi gıdalar dikkate alınmıştır. pH 4’te suşların çoğu 7 gün sonra hayatta kalmamıştır; buna karşılık E. coli O103: H1’in 2,2 log CFU/ml’lik popülasyonu 7 gün sonra hayatta kalmış ve 14 gün sonra 1,8 log CFU/ml kalmıştır. pH 5’in üzerinde suşların çoğu gelişimde herhangi bir güçlük göstermemiştir; E. coli O26: H11 ve E. coli O111: NM ise ilk hafta boyunca diğer suşlardan anlamlı derecede (P < 0,05) daha az gelişim göstermiştir. Asidik stres, STEC’nin çevrede, gıda işleme sırasında veya gıda matrislerinde karşılaşabileceği bir strestir. Genellikle benzoat, sorbat, propiyonat ve sitrat gibi farklı organik asitler hafif asidik koşullarla (pH 4–7) birlikte bulunur. STEC’nin pH etkisi altında hayatta kalması, esas olarak doğal direnci nedeniyle araştırılmıştır. Mide asitliğini taklit eden koşullara maruz bırakıldığında E. coli O157’nin, E. coli O26: H11 ve E. coli O111: H8 gibi O157 dışı STEC’lerden daha dirençli olduğu gösterilmiştir (Bergholz ve Whittam, 2007). Bu durum, söz konusu iki suşun maruziyetin ilk haftasında pH 5’te diğer suşlardan anlamlı derecede daha az gelişim gösterdiğine ilişkin sonuçlarımızla tutarlıdır.

Klor stresi sonrasında hayatta kalma

8 log CFU/ml düzeyindeki STEC hücreleri 22 °C’de 24 saat boyunca NaOCl’ye (1, 2 ve 5 ppm) maruz bırakıldıktan sonra her suşun hayatta kalma eğrisi çizilmiş ve Student t testiyle karşılaştırılmıştır (Şekil 2A). Klor maruziyeti sırasında hayatta kalan STEC popülasyonları arasında anlamlı farklılıklar (P < 0,05) bulunmuştur. 2 ppm NaOCl altında E. coli O26: H11, E. coli O103: H1, E. coli O104: H4 ve E. coli O145: NM suşlarında, E. coli O157: H7 dâhil diğer suşlara kıyasla anlamlı derecede daha yüksek popülasyonlar gözlenmiştir. 24 saat sonra E. coli O26: H11 ve E. coli O103: H1 popülasyonları sırasıyla 6,1 ve 5,6 log CFU/ml iken diğer suşlar 3 log CFU/ml’nin altında kalmıştır. 1 ppm klor uygulamasında E. coli O104: H4, suşlar arasında anlamlı derecede en yüksek hayatta kalmayı göstermiştir (P < 0,05). 24 saatlik maruziyetten sonra hücreler PBS ile yıkanmış, toplanmış ve tekrar klora maruz bırakılmıştır. STEC suşları, klor stresine maruziyet sayısına (1–4) göre G0, G1, G2 ve G3 olarak adlandırılmıştır. Öldürücü olmayan stres sonrasında kazanılan direnci ele almak için her nesilden stres uygulanmış STEC suşları 48 saat boyunca 2 ppm klora maruz bırakılmıştır (Şekil 2B). E. coli O111: NM ve E. coli O121: NM dışındaki her suşun dördüncü nesli (G3), diğer nesillerden anlamlı derecede (P < 0,05) daha yüksek hayatta kalma oranı göstermiştir. Bu, G3’ün öldürücü olmayan klora görece en dirençli nesil olduğunu göstermektedir. Klorun etkinliği, ortamda başka organik maddelerin bulunduğu matrise güçlü biçimde bağlı olabilir. Bununla birlikte, gıda işleme tesislerindeki ekipman yüzeylerinin, Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları sistemine eşlik eden ön gereksinim programının gerektirdiği sanitasyon ve temizlik prosedürleriyle işlendiğini varsayıyoruz. Bazı STEC’ler bu prosedürlere dayanarak organik madde bulunmayan yüzeyde kalabilir. Gıda üretiminde STEC riskini azaltmaya yönelik müdahale stratejileri arasında klor, yıkama veya sanitasyon maddesi olarak yaygın biçimde kullanılır. Bu çalışmadaki klor stresi koşulları, STEC’nin gıda üretimi sırasında veya işleme ortamında karşılaşabileceği koşulları taklit etmektedir. Hayatta kalan E. coli O157: H7’nin art arda öldürücü olmayan miktarlarda klora maruz kalması, klor stresine yanıtta rol oynayan ycfR ekspresyonunu uyarabilir (Hou ve ark., 2013). Bu, E. coli O157: H7’nin marula tutunmasını ve kolonizasyonunu destekler ve daha iyi gelişime yol açar. Diğer çalışmalarda klor uygulaması altında ycfR ekspresyonu on kat artmıştır (Zhang ve ark., 2007; Mermod ve ark., 2012). Klor stresi altında bu genin yüzey hidrofobikliği ve biyofilm oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir (Gonzalez-Escobedo ve Gunn, 2013). Ayrıca bu genin, taze ürünlerin hasat sonrası asgari işlenmesi sırasında Salmonella enterica’nın yüzeye tutunmasına ve hayatta kalmasına katkıda bulunduğu bilinmektedir (Salazar ve ark., 2013).

Şekil 2.

Büyük görüntüle Slaytı indir

O157 dışı Shiga toksini üreten Escherichia coli (STEC) suşlarının bazıları klor uygulamasına E. coli O157’den daha dirençlidir. (A) 37 °C’de gece boyunca geliştirilmiş 8 log CFU/ml STEC’ye öldürücü olmayan sodyum hipoklorit konsantrasyonları [1 (a), 2 (b) ve 5 ppm (c)] uygulanmış; ardından örnekleme, nötralizasyon, TSA plaklarına ekim ve sayılana kadar 37 °C’de inkübasyon yapılmıştır. Üç bağımsız deneyin verileri ortalama ± standart hata (SE) olarak sunulmuştur. * P < 0,05. (B) Klora karşı kazanılmış direnci bulunan STEC hücrelerine [O26 (a), O103 (b), O104 (c), O111 (d), O121 (e), O145 (f), O157 (g)] (G0, G1, G2 ve G3) uzun süre (48 saat) klor (2 ppm) uygulanmıştır. Hücreler yukarıdaki gibi sayılmıştır. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalamasıdır.

Streslerin virülansla ilişkili genlerin göreli ekspresyonuna etkisi

STEC’de virülansla ilişkili çeşitli genler tanımlanmıştır (Kaper ve ark., 2004). Bunlar arasından stx 1, stx 2 ve eae, klor streslerinin bu genlerin göreli ekspresyonuna etkisini RT-PCR ile araştırmak üzere seçilmiştir. Şekil 3A’da gösterildiği gibi O103: H1, O104: H4, O145: NM ve O157: H7’ye art arda öldürücü olmayan klor uygulanması, kontrol hücrelerine kıyasla stx 1’in göreli gen ekspresyonunda anlamlı (P < 0,05) bir artışa (>1,4 kat) yol açmıştır. Benzer şekilde klor stresi uygulanmış O103: H1 hücrelerinde, kontrol hücrelerine kıyasla stx 2’nin göreli gen ekspresyonunda anlamlı (P < 0,05) bir artış (>2 kat) görülmüştür. O104: H4 ve O145: NM hücrelerinde hafif bir artış (1,27–1,38 kat), O26: H11’de ise stx2 açısından büyük bir artış (1,92 kat) görülmüştür (Şekil 3B). Öte yandan klor stresi uygulanmış O111: NM, O121: NM ve O157: H7 hücrelerinde seçilen genlerin ekspresyonu kontrol hücrelerine benzer veya biraz daha düşük bulunmuştur. eae’nin göreli gen ekspresyonu, kontrol hücrelerine kıyasla eae’de iki kat artış gösteren stres uygulanmış O111: NM hücreleri dışında, çoğunlukla stx1 ve stx2 örüntülerine benzer olmuştur (Şekil 3C). Çalışmalar, virülansla ilişkili genlerin ekspresyonunun STEC’nin taze ürünlerde daha iyi hayatta kalması veya gelişmesiyle bağlantılı olduğunu bildirmiştir. Robinson ve ark. (2006), bir STEC suşunun stx 2 mutantının epitel hücrelerine tutunmada yabanıl tip karşılığından daha az etkili olduğunu ileri sürmüştür. Ayrıca mutantın fare bağırsağını kolonize etme kapasitesi daha düşük bulunmuş; bu da Shiga toksininin, muhtemelen insanlarda da, bağırsak kolonizasyonunu desteklediğini göstermiştir. Ancak Sheng ve ark. (2006), E. coli O157: H7’nin sığır rektal mukozasının son bölümünü kolonize etmek için intimin, Tir ve pO157 varlığına ihtiyaç duyduğunu; aktif stx genlerinin yokluğunda ise kolonizasyonun normal ilerlediğini belirtmiştir (Los ve ark., 2012). Patojenin ortamı aniden değiştiğinde bir dizi stres yanıtı geni uyarılır. Yakın tarihli bir çalışma (Kocharunchitt ve ark., 2014), aw’nin aniden düşmesinin gelişim kinetiğinde, besin metabolizmasında, hücre yapısı bileşenlerinde, genel stres yanıtında ve virülans özelliklerinde genel değişiklikler oluşturduğunu göstermiştir. Virülansla ilişkili genlerin göreli transkripsiyon düzeyindeki değişiklikler, klor stresine verilen genel stres yanıtına bağlı olabilir. Bulgularımız, klor stresinin stres yanıtı genlerinin olası mekanizmaları aracılığıyla virülansla ilişkili genlerin ekspresyonunu uyarabileceğini düşündürmektedir.

Şekil 3.

Büyük görüntüle Slaytı indir

Klor uygulaması, Shiga toksini üreten Escherichia coli’de (STEC) virülans genlerinin ekspresyonunu artırır. stx1 (A), stx2 (B) ve eae (C) göreli düzeylerini belirlemek için STEC’ye kantitatif RT-PCR uygulanmıştır. stx1, stx2 ve eae genlerinin Ct (eşik döngüsü) değerleri, temel hücresel işlev geni mdh’nin değerine göre normalize edilmiştir. Daha sonra stres uygulanmış hücrelerdeki virülans genlerinin göreli bolluğu, kontrol hücrelerindeki karşılık gelen genlerin ekspresyon düzeyine göre normalize edilerek hesaplanmıştır. Üç bağımsız deneyin verileri ortalama ± SE olarak sunulmuştur. * P < 0,05.

Streslerin Vero hücrelerindeki sitotoksisiteye etkisi

Stres uygulanmış (G3) ve kontrol STEC hücrelerinden alınan filtrelenmiş süpernatant örnekleri, LDH testi kullanılarak Shiga toksini varlığı açısından incelenmiştir. Kontrol ve stres uygulanmış hücrelerde Vero sitotoksisitesi zamanla artmış, bu da toksin üretiminin zamana bağlı olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). E. coli O103: H1 dışında hem stres uygulanmış hem de kontrol hücrelerinde sitotoksisite 24 saatlik gelişim sonrasında en yüksek düzeye ulaşmıştır. O103: H1 için inkübasyon sırasında en yüksek üretim kontrol hücrelerinde 36 saatte, stres uygulanmış hücrelerde 48 saatte gözlenmiştir. Bu nedenle deneyler için 24 saatlik gelişim seçilmiştir. Stres uygulanmış ve kontrol hücreleri arasındaki sitotoksisite farkını ele almak için her iki gruptan 24 saatlik gelişim sonrasında süpernatant örnekleri toplanmış ve Vero sitotoksisitesi incelenmiştir (Şekil 4B). E. coli O26: H11 (%40), E. coli O103: H1 (%50), E. coli O104: H4 (%60) ve E. coli O145: NM’de (%25), stres uygulanmış ve kontrol hücreleri arasında sitotoksisite (%) açısından anlamlı (P < 0,05) bir artış bulunmuştur. Stres uygulanmış E. coli O157: H7 hücreleri de kontrol hücrelerine kıyasla artmış sitotoksisite göstermiştir; ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (P < 0,05). Stres uygulanmış ve kontrol hücrelerinin süpernatantlarının ilk 24 saat boyunca zamanla artan Vero sitotoksisitesi gösterdiği kaydedilmiştir. Hasar görmüş hücre zarının, sitozolik organların hasarını en aza indirirken daha fazla toksin salınmasını sağlayabileceği düşünülmektedir. Beş günlük açlık ve klor uygulamasından sonra bakteriyel toparlanmayı inceleyen bir çalışmada, Vero sitotoksisitesi bakımından kontrol ve stres uygulanmış STEC arasında fark bulunmamıştır (Kolling ve Matthews, 2007). STEC’lerin Shiga toksini üretmesinin başlıca nedeni, kendilerini avcılardan veya konak memelinin bağışıklık sisteminden korumak olabilir (Los ve ark., 2012). Öldürücü olmayan klor maruziyetiyle hasar görmüş Campylobacter jejuni’nin HeLa hücrelerinde düşük invazyon potansiyeli gösterdiği bir çalışmada benzer bir sonuç elde edilmiştir (Terzieva ve McFeters, 1992). Buna karşılık Yersinia enterocolitica, Salmonella typhimurium ve enterotoksijenik E. coli üzerinde fare LD50, tutunma ve invazyon testlerine dayanan bir virülans çalışması, klor uygulamasının bunların virülansını zayıflattığını göstermiştir (LeChevallier ve ark., 1985). STEC’nin ürettiği Shiga toksininin artmış salınımı, konakların bağışıklık sistemlerine karşı savunma sağlayan koruyucu bariyerler oluşturarak ve istilacı mikroorganizmaların yaşam süresini uzatarak organizmalara yarar sağlayabilir. Salmonella enteritidis ve S. typhimurium’un klor stresine transkriptomik yanıtları, klor uygulaması altında S. typhimurium’da Salmonella patojenite adası (SPI) 1’deki genlerin yarısının ekspresyonunun azaldığını ortaya koymuştur. Bu, klor stresinin tip III salgılama sisteminin biyosentezini ve kurulmasını etkileyerek S. typhimurium’da virülansı azaltabileceğini düşündürürken aynı koşullarda S. enteritidis’in SPI genlerinin ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik görülmemiştir (Wang ve ark., 2010). Ayrıca et işlemede tuz kullanımına bağlı ozmotik stres, qRT-PCR ve Western blot sonuçlarına göre Shiga toksini üretimini artırmıştır (Harris ve ark., 2012). Lee ve ark. (2012), farklı genotiplere (stx1, stx2 veya her ikisi) sahip suşların aynı strese farklı yanıt verebileceğini ileri sürmüştür. Bir stres türüne daha dirençli suşun diğer stres türlerine de daha dirençli olma eğiliminde olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışmada stres uygulanmış O26: H11, O103: H1, O104: H4 ve O145: NM’de stx1 veya stx2 ekspresyonunun daha yüksek bulunması, onların bulgularıyla uyumludur. Bu çalışmada, Vero hücre kültüründeki sitotoksik etkiye her toksinin göreli katkısını normalize etmek için 43888 (stx1 ve stx2 içermez), 43889 (stx2 pozitif) ve 43890 (stx1 pozitif) suşlarından oluşan bir E. coli O157: H7 kokteyli (Jothikumar ve Griffiths, 2002) kontrol olarak kullanılmıştır. Bunun O157: H7 kontrol hücrelerindeki sitotoksisite değişkenliğinin daha büyük olmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir (Şekil 4). Seçilen O157 dışı STEC suşlarının stres uygulanmış hücrelerinde stx1 ve stx2 ya da eae genlerinin göreli bolluğu, stres uygulanmamış kontrol hücrelerine kıyasla bu hücrelerin Vero sitotoksisitesini artırabilir.

Şekil 4.

Büyük görüntüle Slaytı indir

Klor stresi, O157 dışı Shiga toksini üreten Escherichia coli’nin (STEC) Vero sitotoksisitesini uyarır. Vero sitotoksisitesi, STEC hücrelerinin süpernatantlarıyla muamele edilmiş Vero hücrelerinde laktaz dehidrogenaz testi kullanılarak değerlendirilmiştir. (A) STEC’den 48 saat boyunca her 12 saatte bir süpernatant toplanmıştır. (B) Süpernatantlar 24 saatlik gelişim sonrasında toplanmıştır. Vero sitotoksisitesi belirlenmiş ve her hücre yoğunluğu popülasyonuna göre normalize edilmiştir. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalamasıdır. * P < 0,05.

Sonuçlar

Bu çalışmada stres uygulanmamış ve stres uygulanmış STEC arasındaki sitotoksisite düzeyi karşılaştırılmıştır. Sonuçlar, STEC’nin öldürücü olmayan klor uygulamasına tekrar tekrar maruz kalmasının STEC O26: H11, O103: H1, O104: H4 ve O145: NM’de Vero sitotoksisitesi düzeylerini artırabileceğini ve bunun virülans artışına yol açabileceğini düşündürmektedir. Bu sonuç, STEC O103: H1, O104: H4 ve O145: NM’de virülansla ilişkili genlerin artmış ekspresyonuyla desteklenmiştir. Öldürücü olmayan klor uygulamasının sitotoksisite bakımından daha fazla risk oluşturabileceğini varsayıyoruz. Ancak olası riskleri daha iyi değerlendirmek için Shiga toksininin salınmasında ve virülansla ilişkili genlerin ekspresyonunun artmasında rol oynayan etkenleri ayrıntılı biçimde ele alacak kapsamlı biyokimyasal deneyler gerekecektir.

Teşekkür

Yazarlar, deneyde kullanılan bakteri suşlarını sağlayan Wyndmoor, Pennsylvania’daki ERRC/ARS/USDA’dan Dr Pina Fratamico ve Lori Bagi’ye teşekkür eder.

Çıkar çatışması beyanı. Bildirilmemiştir.

Kaynaklar

Althaus D. Hofer E. Corti S. Julmi A. Stephan R. (2012). Bacteriological survey of ready-to-eat lettuce, fresh-cut fruit, and sprouts collected from the Swiss market. Journal of Food Protection, 75: 1338–1341.

Baylis C. L. MacPhee S. Robinson A. J. Griffiths R. Lilley K. Betts R. P. (2004). Survival of Escherichia coli O157: H7, O111: H- and O26: H11 in artificially contaminated chocolate and confectionery products. International Journal of Food Microbiology, 96: 35–48.

Beney L. Mille Y. Gervais P. (2004). Death of Escherichia coli during rapid and severe dehydration is related to lipid phase transition. Applied Microbiology and Biotechnology, 65: 457–464.

Bergholz T. M. Whittam T. S. (2007). Variation in acid resistance among enterohaemorrhagic Escherichia coli in a simulated gastric environment. Journal of Applied Microbiology, 102: 352–362.

Brooks J. T. et al.. (2005). Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in the United States, 1983–2002. Journal of Infectious Diseases, 192: 1422–1429.

Centers for Disease Control and Prevention (2006). Ongoing multistate outbreak of Escherichia coli serotype O157: H7 infections associated with consumption of fresh spinach--United States, September 2006. Morbidity and Mortality Weekly Report, 55: 1045–1046.

Deng K. Wang S. Rui X. Zhang W. Tortorello M. L. (2011). Functional analysis of ycfR and ycfQ in Escherichia coli O157: H7 linked to outbreaks of illness associated with fresh produce. Applied and Environmental Microbiology, 77: 3952–3959.

Erkmen O. (2010). Antimicrobial effects of hypochlorite on Escherichia coli in water and selected vegetables. Foodborne Pathogens and Disease, 7: 953–958.

Fratamico P. M. et al.. (2011). Detection by multiplex real-time polymerase chain reaction assays and isolation of Shiga toxin-producing Escherichia coli serogroups O26, O45, O103, O111, O121, and O145 in ground beef. Foodborne Pathogens and Disease, 8: 601–607.

Gonzalez-Escobedo G. Gunn J. S. (2013). Identification of Salmonella enterica serovar Typhimurium genes regulated during biofilm formation on cholesterol gallstone surfaces. Infection and Immunity, 81: 3770–3780.

Gould L. H. et al.. (2013). Increased recognition of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in the United States during 2000–2010: epidemiologic features and comparison with E. coli O157 infections. Foodborne Pathogens and Disease, 10: 453–460.

Harris S. M. et al.. (2012). Salt at concentrations relevant to meat processing enhances Shiga toxin 2 production in Escherichia coli O157: H7. International Journal of Food Microbiology, 159: 186–192.

Hiramatsu R. Matsumoto M. Sakae K. Miyazaki Y. (2005). Ability of Shiga toxin-producing Escherichia coli and Salmonella spp. to survive in a desiccation model system and in dry foods. Applied and Environmental Microbiology, 71: 6657–6663.

Hou Z. Fink R. C. Sugawara M. Diez-Gonzalez F. Sadowsky M. J. (2013). Transcriptional and functional responses of Escherichia coli O157: H7 growing in the lettuce rhizoplane. Food Microbiology, 35: 136–142.

House B. et al.. (2009). Acid-stress-induced changes in enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7 virulence. Microbiology, 155: 2907–2918.

Jothikumar N. Griffiths M. W. (2002). Rapid detection of Escherichia coli O157: H7 with multiplex real-time PCR assays. Applied and Environmental Microbiology, 68: 3169–3171.

Ju W. et al.. (2012). Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli in retail ground beef and pork in the Washington, D.C. area. Food Microbiology, 32: 371–377.

Kaper J. B. Nataro J. P. Mobley H. L. (2004). Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology, 2: 123–140.

Karmali M. A. Gannon V. Sargeant J. M. (2010). Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC). Veterinary Microbiology, 140: 360–370.

Kocharunchitt C. King T. Gobius K. Bowman J. P. Ross T. (2014). Global genome response of Escherichia coli O157: H7 Sakai during dynamic changes in growth kinetics induced by an abrupt downshift in water activity. PLoS One, 9: e90422.

Kolling G. L. Matthews K. R. (2007). Influence of enteric bacteria conditioned media on recovery of Escherichia coli O157: H7 exposed to starvation and sodium hypochlorite. Journal of Applied Microbiology, 103: 1435–1441.

Korzeniewski C. Callewaert D. M. (1983). An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods, 64: 313–320.

Lappalainen K. Jaaskelainen I. Syrjanen K. Urtti A. Syrjanen S. (1994). Comparison of cell proliferation and toxicity assays using two cationic liposomes. Pharmaceutical Research, 11: 1127–1131.

LeChevallier M. W. Singh A. Schiemann D. A. McFeters G. A. (1985). Changes in virulence of waterborne enteropathogens with chlorine injury. Applied and Environmental Microbiology, 50: 412–419.

Lee K. et al.. (2012). Variation in stress resistance patterns among stx genotypes and genetic lineages of shiga toxin-producing Escherichia coli O157. Applied and Environmental Microbiology, 78: 3361–3368.

Los J. M. Los M. Wegrzyn A. Wegrzyn G. (2012). Altruism of Shiga toxin-producing Escherichia coli: recent hypothesis versus experimental results. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2: 166.

Mermod M. Magnani D. Solioz M. Stoyanov J. V. (2012). The copper-inducible ComR (YcfQ) repressor regulates expression of ComC (YcfR), which affects copper permeability of the outer membrane of Escherichia coli. Biometals, 25: 33–43.

Michino H. et al.. (1999). Massive outbreak of Escherichia coli O157: H7 infection in schoolchildren in Sakai City, Japan, associated with consumption of white radish sprouts. American Journal of Epidemiology, 150: 787–796.

Mingle L. A. et al.. (2012). Enhanced identification and characterization of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli: a six-year study. Foodborne Pathogens and Disease, 9: 1028–1036.

Monaghan A. Byrne B. Fanning S. Sweeney T. McDowell D. Bolton D. J. (2011). Serotypes and virulence profiles of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from bovine farms. Applied and Environmental Microbiology, 77: 8662–8668.

Montet M. P. et al.. (2009). Fate of acid-resistant and non-acid resistant Shiga toxin-producing Escherichia coli strains in experimentally contaminated French fermented raw meat sausages. International Journal of Food Microbiology, 129: 264–270.

Olesen I. Jespersen L. (2010). Relative gene transcription and pathogenicity of enterohemorrhagic Escherichia coli after long-term adaptation to acid and salt stress. International Journal of Food Microbiology, 141: 248–253.

Paton A. W. Srimanote P. Talbot U. M. Wang H. Paton J. C. (2004). A new family of potent AB(5) cytotoxins produced by Shiga toxigenic Escherichia coli. Journal of Experimental Medicine, 200: 35–46.

Paton J. C. Paton A. W. (2003). Methods for Detection of STEC in Humans. Humana Press Inc., Totowa, NJ.

Pfaffl M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 29: e45.

Price S. B. et al.. (2000). Role of rpoS in acid resistance and fecal shedding of Escherichia coli O157: H7. Applied and Environmental Microbiology, 66: 632–637.

Robinson C. M. Sinclair J. F. Smith M. J. O’Brien A. D. (2006). Shiga toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli type O157: H7 promotes intestinal colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 103: 9667–9672

Salazar J. K. Deng K. Tortorello M. L. Brandl M. T. Wang H. Zhang W. (2013). Genes ycfR, sirA and yigG contribute to the surface attachment of Salmonella enterica Typhimurium and Saintpaul to fresh produce. PLoS One, 8: e57272.

Sheng H. Lim J. Y. Knecht H. J. Li J. Hovde C. J. (2006). Role of Escherichia coli O157: H7 virulence factors in colonization at the bovine terminal rectal mucosa. Infection and Immunity, 74: 4685–4693.

Terzieva S. I. McFeters G. A. (1992). Effect of chlorine injury on some virulence-related properties of Campylobacter jejuni. International Journal of Environmental Health Research, 2: 24–32.

Thorpe C. M. (2004). Shiga toxin-producing Escherichia coli infection. Clinical Infectious Diseases, 38: 1298–1303.

Wang Y. Nordhues B. A. Zhong D. De Guzman R. N. (2010). NMR characterization of the interaction of the Salmonella type III secretion system protein SipD and bile salts. Biochemistry, 49: 4220–4226.

Williams R. C. et al.. (2000). Illness outbreak associated with Escherichia coli O157: H7 in Genoa salami. E. coli O157: H7 Working Group. Canadian Medical Association Journal, 162: 1409–1413.

Yoo B. K. Chen J. (2010). Role of cellulose in protecting Shiga toxin-producing Escherichia coli against osmotic and chlorine stress. Journal of Food Protection, 73: 2084–2088.

Zhang X. S. Garcia-Contreras R. Wood T. K. (2007). YcfR (BhsA) influences Escherichia coli biofilm formation through stress response and surface hydrophobicity. Journal of Bacteriology, 189: 3051–3062

Zhejiang University Press adına Oxford University Press tarafından 2017’de yayımlanmıştır. Bu çalışma ABD Hükûmeti çalışanı/çalışanları tarafından yazılmıştır ve ABD’de kamu malıdır.

Makalenin özgün kaynağı: Oxford University Press

.